Nature Biomedical Engineering | Hybrid gRNA技术破解碱基编辑"精准与效率"双重难题

一、引言：碱基编辑技术的"精准悖论"

在CRISPR基因编辑从"剪刀"到"铅笔"的技术跃迁中，碱基编辑器（Base Editors）以其无需切断DNA双链即可实现单碱基精准替换的能力，被誉为新一代基因治疗的核心工具。腺嘌呤碱基编辑器（ABE）能够在基因组中实现A·T到G·C的转换，理论上可矫正约50%的人类致病性点突变。

然而，这项技术在临床转化过程中始终面临一个核心矛盾：如何在保证高编辑效率的同时，最大限度降低脱靶编辑（off-target editing）和旁观编辑（bystander editing）。

传统优化策略主要聚焦于改造编辑器蛋白本身，但蛋白工程往往伴随效率下降、免疫原性增加等新问题。宾夕法尼亚大学医学院团队另辟蹊径，近期在《Nature Biomedical Engineering》发表的研究中，提出了一个极具创新性的解决方案——Hybrid gRNA（混合型向导RNA）技术。该技术通过RNADNA杂合设计，在三种代谢性遗传病模型中实现了安全性与效率的双重突破，为体内基因编辑疗法建立了新的安全标准。研究题目为《Optimized adenine base editor reduces off-target editing and alters physiological phenotype in metabolic disease models》。

二、技术背景与创新逻辑：从"蛋白改造"到"RNA化学修饰"的转换

（1）问题的根源：RNA-DNA配对的"容错性困境"

传统CRISPR系统依赖全RNA向导链（gRNA）识别目标DNA序列。然而，RNA-DNA异源双链配对的结构特性导致系统对错配的容忍度过高，这种"容错性"在不同层面引发了三大安全隐患：

1. 脱靶编辑（Off-target editing）：gRNA与基因组中相似序列发生错配结合，在非目标位点产生不必要的突变。如标准gRNA在PAH基因P281L突变位点的编辑中，可产生7个验证脱靶位点，最高脱靶率达2.1%。

2. 旁观编辑（Bystander editing）：目标位点编辑窗口（通常为第4-8位）内的其他腺嘌呤被意外修饰。例如在PAH基因编辑中，旁观A→G编辑率可达4.4%，可能导致新的有害突变。

3. 变异相关脱靶（Variantinduced off-target）：人群遗传变异可在个体基因组中创造新的脱靶位点，这在传统的单一参考基因组分析中被完全忽略。

（2）Hybrid gRNA的化学设计逻辑

研究团队的核心创新在于：在gRNA的spacer区域（第3-10位）用DNA核苷酸选择性替换部分RNA核苷酸，构建RNADNA杂合体。这一设计基于三层化学原理：

1. DNA-DNA配对严格性：DNADNA双链的沃森-克里克配对几何构型更为严格，对错配的容忍度显著低于RNA-DNA异源双链，从而提高了靶标识别的精准度。

2. 保留RNA功能域：在gRNA的PAM远端和近端保留RNA结构，确保与Cas蛋白的正常结合以及RNP复合体的组装效率。

3. 化学修饰增强稳定性：在gRNA的3'端和5'端保留2'-O-甲基化（2-'OMe）和硫代磷酸化（PS）修饰，增强了体内稳定性并降低免疫原性。

三、关键实验结果与突破性发现

（1）评估候选临床先导gRNAs的靶向和脱靶编辑

图1展示了本研究评估的五个基因位点（PAH P281L、PAH R408W、ABCC6 R1164X、HPD剪接位点）的基因组示意图，以及ONE-seq方法的流程图。示意图标注了每个位点的靶点腺嘌呤位置（红色）、原间隔序列（灰色粗条）和PAM序列（灰色细条），ONE-seq部分详细描述了用于候选脱靶位点的生化实验流程。

图1

（2）优化PAH P281L变体的体外和体内校正

图2系统展示了PAH1 gRNA的hybrid设计（包括21种变体，如hyb1-hyb21），在PAH P281L HuH-7细胞中的靶向编辑效率、旁观编辑和脱靶编辑（如PAH1_OT3位点）数据，以及ONE-seq分析（脱靶位点数量）。还包括小鼠体内实验数据：LNP递送后，肝脏编辑效率、血液苯丙氨酸水平恢复正常，以及小鼠脱靶位点（PAH1_mOT3）的编辑情况。

图2

重要实验结论：通过系统筛选hybrid gRNA设计，发现特定DNA核苷酸替换（如hyb16/17，位置4-6或5-7）能显著降低脱靶编辑（如PAH1_OT3从1.3%降至背景水平）和旁观编辑（从4.4%降至~1%），同时提高靶向编辑效率（从~90%维持或提升至50-60%）。优化后的hybrid gRNA（如PAH1_hyb24）在变异感知分析中几乎消除所有脱靶风险（ONE-seq分数>0.01的位点降至0）。在小鼠模型中，hybrid gRNA使血液苯丙氨酸水平完全恢复正常（<125 μmol/L），证实其体内高效性和安全性，为PKU治疗提供了临床候选方案。

（3）优化ABCC6 R1164X变体的体外和体内校正

图3针对PXE1 gRNA的hybrid设计（21种变体），展示了在ABCC6 R1164X HuH-7细胞中的靶向编辑效率、旁观编辑和脱靶编辑（如PXE1_OT1/OT2位点）数据，以及ONE-seq分析。还包括小鼠体内实验：LNP递送后，肝脏编辑效率和血液吡rophosphate水平改善。

图3

重要实验结论：hybrid gRNA（如PXE1_hyb18）能有效减少脱靶编辑（如OT1位点从13.4%降至0.6%）和旁观编辑（从6.3%降至~3%），同时提升靶向编辑效率（从32%至50%）。在小鼠模型中，编辑效率提高（29%矫正编辑），血液吡rophosphate水平恢复正常，且安全性指标（ALT、细胞因子）无异常。结论表明，hybrid gRNA策略在PXE治疗中兼具高效性和低风险，支持其临床转化潜力。

（4）优化HPD基因两个位点的靶向编辑with hybrid gRNAs

图4

重要实验结论：hybrid gRNA（如HPD20_hyb22/23）在保持高效靶向编辑（>60%）的同时，显著减少旁观编辑和脱靶潜力（ONE-seq分数>0.01的位点最少）。对于HPD4 gRNA，hybrid设计将脱靶编辑（HPD4_OT13）从4.9%降至背景水平。结论表明，该策略适用于HPD基因 inactivation（HT1治疗），能精准破坏剪接位点而无显著副作用，扩展了hybrid gRNA在非矫正性编辑中的应用。

（5）使用PAM-relaxed ABE优化PAH R408W变体的校正

图5针对PAH R408W变体（缺乏NGG PAM），使用SpRY-ABE8.8编辑器和PAH4 gRNA，展示了hybrid设计（如hyb9-hyb21）的靶向编辑效率、旁观编辑数据，以及ONE-seq分析的脱靶潜力。

图5

重要实验结论：在PAM-relaxed编辑器（SpRY-ABE8.8）中，hybrid gRNA能减少脱靶潜力（ONE-seq位点数量下降），同时保持或提高靶向编辑效率，并降低有害旁观编辑（如位置10的非同义变异）。结论表明，hybrid gRNA策略兼容PAM-relaxed系统，扩展了可编辑靶点范围（如PKU常见突变），且不牺牲安全性，为罕见病治疗提供了新途径。

四、研究总结与核心突破

本研究系统性地验证了Hybrid gRNA技术在提升体内腺嘌呤碱基编辑（ABE）疗法特异性与效率方面的巨大潜力。通过对针对phenylketonuria（PKU）、弹性假黄瘤（PXE）及遗传性酪氨酸血症1型（HT1）相关基因（PAH, ABCC6, HPD）的多个先导gRNA进行优化，研究团队取得了三大核心突破：

1. 双重风险同步降低：成功实现了脱靶编辑（off-target editing）与旁观编辑（bystander editing）的同步显著降低。例如，优化后的PAH1_hyb24 gRNA将PAH1_OT3位点的脱靶编辑从1.3%降至背景水平，并将有害的旁观编辑从4.4%降至约1%。

2. 编辑效率不降反升：突破性地发现，在降低风险的同时，靶向编辑效率（on-target editing）并未受损，反而在体内外实验中均得到显著提升。在PKU小鼠模型中，PAH1_hyb23/24 gRNA将矫正编辑效率从40%提升至50-60%，并完全逆转了疾病表型（血液苯丙氨酸水平恢复正常）。

3. 通用性平台技术确立：研究确立了 “hyb16/hyb17”（即在间隔序列第4-6或5-7位进行DNA核苷酸替换）作为一套行之有效的通用设计起点，该策略在不同基因位点（PAH, ABCC6, HPD）、不同编辑器（ABE8.8, SpRY-ABE8.8）中均表现出优异的优化效果，展现了其作为平台技术的强大普适性。

五、研究的深层意义与行业影响

（1）技术范式转移：从“蛋白中心”到“RNA-DNA协同”

本研究的深层意义在于实现了一次技术优化范式的转移。过去，提升CRISPR系统特异性的努力主要集中于对Cas蛋白的工程化改造（如高保真变体）。而Hybrid gRNA技术另辟蹊径，将优化焦点转移到gRNA的化学生物学修饰上。这种“RNA-DNA协同”的策略，在不改变编辑器蛋白本身的前提下，通过增强gRNA与DNA靶点的识别精确度，从源头上减少了错误配对的可能性。这为基因编辑工具的优化开辟了一条全新的、更具可操作性的道路。

（2）安全性标准的重塑：引入“变异感知”分析

本研究首次在碱基编辑疗法的临床前研究中系统性地整合了 “变异感知（variant-aware）”的脱靶分析。该方法考虑了人类群体中天然存在的遗传变异可能创造出的新脱靶位点，弥补了传统基于单一参考基因组分析的盲区。结果显示，Hybrid gRNA能有效消除这些个体化脱靶风险，为未来个体化基因治疗的安全评估树立了新的黄金标准，极大地增强了疗法的可靠性与临床应用前景。

（3）临床转化路径的明确与加速

对于基因治疗企业而言，此项研究的价值在于它提供了一条清晰、可复制、低风险的临床转化路径。

1. 平台化优势：hyb16/hyb17等通用设计原则意味着针对新靶点的gRNA优化可以有一个高成功率的起点，显著缩短了候选药物前期的研发周期。

2. 监管友好性：该技术能产生全面、令人信服的脱靶和旁观编辑数据包，满足监管机构（如FDA/NMPA）对基因治疗产品安全性的严苛要求，为顺利通过IND（新药临床试验）申请增添了重要砝码。

3. 商业化潜力：该技术可直接整合至成熟的mRNA-LNP递送平台，无需开发全新的生产工艺，利于快速推进至规模化生产。针对PKU（全球约5万患者）、PXE等罕见病，其孤儿药资格将为产品带来巨大的市场价值和发展优势。

六、未来展望与技术演进方向

（1）技术本身的深度优化

1. 理性设计：未来需要结合结构生物学（如解析Hybrid gRNA-DNA-Cas9三元复合体结构）和机器学习，建立更精准的理性设计算法，实现从“经验筛选”到“计算预测”的跨越。

2. 应用范围拓展：将Hybrid gRNA的设计理念迅速扩展至胞嘧啶碱基编辑器（CBE）、先导编辑器（Prime Editor）乃至表观遗传编辑器等更多CRISPR系统，释放其全平台潜力。

3. 长期安全性：在非人灵长类动物等大模型中开展长期安全性评价，进一步验证该技术的长期可靠性和免疫原性特征。

（2）临床应用的广阔前景

1. 治疗领域扩展：Beyond肝脏表达的遗传病，探索通过新型递送系统将Hybrid gRNA技术应用于神经系统、肌肉组织等更广泛的疾病领域。

2. 组合疗法开发：探索碱基编辑与靶向蛋白降解、小分子药物等联合使用的可能性，为复杂疾病提供综合治疗方案。

3. 迈向“N-of-1”个性化治疗：该技术的高特异性使其成为治疗超罕见突变或个体特有突变的理想工具，推动真正意义上的个性化精准医疗成为现实。

综上所述，宾夕法尼亚大学的这项研究不仅是一项重要的技术突破，更是指引行业发展的里程碑。Hybrid gRNA技术以其卓越的安全性提升、显著的效率优化和强大的平台通用性，成功破解了碱基编辑领域的“精准与效率”悖论。它标志着基因编辑疗法正式从“能编辑”的1.0时代，迈入“精编辑、准编辑、安全编辑”的2.0时代。

七、舒桐科技提供的ABE脱靶检测解决方案

珠海舒桐医疗科技有限公司作为专业的基因编辑服务提供商，针对ABE脱靶检测建立了多层次、全方位的检测体系，为客户提供从计算预测到实验验证的一站式服务。

（1）检测技术平台

（2）整合检测策略

舒桐科技推荐采用分层检测策略，确保脱靶检测的全面性和准确性：

八、临床应用建议

对于计划用于临床的ABE治疗方案，我们建议：

1. 全面预测：使用CRISPRme等工具进行全基因组脱靶预测，考虑目标人群的遗传多样性。

2. 多方法验证：结合WGS、RNA-seq、Selict-seq等至少三种检测方法，确保DNA和RNA水平检测的全面性和准确性。

3. 深度验证：对所有预测的高风险脱靶位点进行扩增子或液相捕获测序验证，确保低频脱靶的准确检出。

4. 长期监测：建立编辑后细胞的长期培养和监测体系，关注可能的迟发性效应[2]。

5. 个性化评估：根据患者的基因型特征，评估个体化的脱靶风险。

九、结语

ABE作为具有巨大临床潜力的基因编辑工具，其安全性评估至关重要。系统性的ABE特异性评估对于任何治疗应用都是必需的。珠海舒桐医疗科技有限公司凭借先进的检测平台和专业的技术团队，为您提供全方位的ABE脱靶检测服务，助力您的基因编辑研究安全、高效地推进。