稳定转染细胞株可应用于重组蛋白、抗体生产、基因编辑、功能性研究和移植瘤构建等多种实验，已成为日常实验操作的一部分。目前构建稳定转染细胞株最常用的方法还是使用慢病毒感染细胞。慢病毒对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型细胞，适用范围广。

但是很多同学特别是新手也会一直为慢病毒感染实验愁眉苦脸，遇到例如：加入慢病毒后细胞状态差或者死亡、GFP的亮度弱、转染效率低下等问题。由于整个慢病毒感染实验周期耗时长，对后续实验影响大，下面舒桐小编提供一份慢病毒转染全攻略，助大家在慢病毒转染实验中乘风破浪。
 

一、慢病毒的储存与稀释

1、病毒液储存：如果短时间（一周）内进行实验，可以将病毒液暂放置4℃保存；如不能在短期内全部使用，需将慢病毒液分装后置于–80℃冰箱保存（根据每次的使用量进行分装，将定量的病毒液置于冻存管中，做好日期和储存量标记，封口膜密封）。病毒液可存放于-80℃冰箱约6个月，如储存时间超过6个月，建议使用前重新测定病毒滴度。

 

注：

a．在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融，反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会降低病毒滴度10%-50%；我司出库前对病毒液行了分装（100μL/tube），收到后直接放置-80℃保存即可。

b．如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前重新测定病毒滴度。（滴度测定方法敬请期待下期细胞实验专栏—新手必看：慢病毒感染全攻略（下））

 

2、病毒液稀释：当需要稀释病毒时，将病毒液取出，置于冰上融解，使用PBS或培养目的细胞的无血清培养基稀释。

病毒液稀释过程（逐步稀释法）

 

 

二、慢病毒感染细胞实验步骤

慢病毒对不同细胞系亲嗜性不同，在使用慢病毒前可以查阅相关文献，了解慢病毒对目的细胞系的感染复数MOI值（MOI在用于病毒感染细胞的研究中时，含义是感染时病毒与细胞数量的比值）。如果无相关文献支持，可以通过预实验获取合适的MOI值。

以24孔培养板为例，进行目的细胞系和293T细胞（平行对照）的感染预实验，按照不同的MOI值设置若干感染孔（可依据经验值设置3个左右梯度），并根据MOI值和细胞数量计算所需要的病毒量，如有必要可以使用PBS溶液或者无血清培养基稀释病毒原液。

 

(1)  Day 1：准备细胞

在 24 孔培养板接种若干孔处于对数生长期的目的细胞和平行对照293T细胞，接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同，一般是保证第二天进行病毒感染时细胞汇合率介于30%-50%之间。放入37℃，5% CO₂培养箱中培养过夜（针对贴壁细胞）。

 

(2)  Day 2：病毒感染（1/2小体积感染法）

4°C保存的病毒，取出后轻轻用移液器混匀; -80℃冻存的病毒在冰上融化后使用。接着感染目的细胞：从培养箱中拿出细胞，观察细胞生长状态，如细胞状态好（细胞状态对转染影响较大），则可以开始实验。

我司根据实验经验，若想得到较好的感染效率，我们推荐1/2小体积感染法，即病毒感染时，加入1/2体积新鲜培养液，慢病毒感染4h后补足至培养体积。如：24孔板的培养液体积为500μL，1/2培养体积为250μL，其他大小的培养皿的培养液体积见下表。

 

a、吸去培养器皿中的旧培养基，用PBS清洗两次，加入1/2体积新鲜培养基。

b、根据摸索的MOI值，加入合适体积的病毒进行感染（每孔加病毒量（μL）=MOI x 细胞数/病毒滴度（TU/mL）×1000），使用移液器吸取准确体积的病毒液加入目的细胞和对照细胞中。

c、将病毒液和培养基混匀，放于二氧化碳培养箱(37℃、5%CO2)孵育培养。4h后补足至完全培养体积继续培养。

 

(3)  Day 3：细胞换液

一般加入病毒液 24 小时后，弃去含病毒的培养液，换上新鲜完全培养液，继续在培箱中进行培养（该时间可根据细胞感染后状态具体调整，若感染后细胞明显皱缩，状态差则建议4-6h进行换液；若感染后细胞状态一直良好，也可以将换液时间延长至感染后48-72h）。

 

(4)  Day 4~5：荧光观察/抗性药物筛选

加入病毒 48-72小时后，对于带 GFP 报告基因的病毒，可通过荧光显微镜观测 GFP 荧光强度，对于携带 Puromycin或者其他抗性基因的病毒，换上含适当浓度抗生素完全培养液（Puromycin 标准终浓度范围为 1-10 μg/mL，不同细胞系Puromycin工作液浓度不同，可查阅文献或者预实验寻找最适Puromycin筛选浓度），进行稳定表达细胞株筛选。

转染48小时293T 细胞GFP荧光强度

 

 (5)  稳定细胞株筛选

将Puromycin筛选后的细胞进行传代，并继续持续施加合适浓度Puromycin 维持抗性，连续筛选并传3代后，冻存保存稳定表达细胞株。

 

三、特殊细胞的感染注意事项

 

1、悬浮细胞

感染悬浮或半悬浮细胞，建议通过平角离心转染法，先重悬细胞，然后将适量的病毒液加入细胞培养皿后， 封好口，放入平角离心机，低速（1200g）离心1 h，然后放入培养箱中正常培养即可。若由于实验条件有限，没有平角离心机，可用离心管代替，将细胞吹打吸入离心管中，进行低速离心，去掉大部分上清，然后加入适量的病毒液，室温放置15 min（尽量不要超过30 min），然后将细胞和病毒液同时吸出转入培养皿中继续病毒感染过夜即可。

 

2、极难感染的细胞

对于极难感染的细胞，如DC（树突状细胞）等，可采用多次感染的方法，即感染24 h后，更换新鲜病毒进行二次感染，可显著提升感染效率。

注：多次感染的时间间隔需要根据细胞状态来调整，要保证每次感染前细胞处于较良好状态。

 

3、传代能力较差的原代细胞

对于一些传代能力较差的原代细胞，比如BMSC等，建议采用滴度更高的腺病毒进行感染。

 

珠海舒桐医疗科技有限公司在慢病毒生产包装和LV-CRISPR基因编辑体系上有非常丰富的经验。生产的慢病毒产品，经过严格质量检测（包括支原体检测、无菌检测和滴度检测等），可满足客户开展细胞及动物体内实验需求。并拥有成熟的慢病毒病毒生产、纯化工艺，生产全流程严格依据GMP规范进行，为广大客户提供高质量，高产量的慢病毒产品。此外，我们还可根据客户的实验需求，提供载体选择—质粒构建—无内毒素提取测序—病毒包装—滴度/感染检测一体化服务。

 

关于舒桐

珠海舒桐医疗科技有限公司深耕基因编辑技术10余年，是一家以基因编辑为核心技术的生物医药服务企业，可承接脱靶检测、细胞株定制、病毒包装等CRO及CDMO业务。目前，舒桐科技拥有3000㎡的GMP研发实验室及生产车间；拥有博士后科研工作站及澳门理工大学教学科研实习基地。研发团队熟练掌握各类基因编辑技术，包括基因编辑、碱基编辑及先导编辑等，成功完成如基因敲除、点突变、大片段插入、过表达等细胞系构建项目；开发了多种具有自主知识产权的脱靶检测技术，建立了高通量的sgRNA筛选平台；建立了工厂化新型CRISPR挖掘体系，已开发出多种切割效率高且低脱靶的新型CRISPR。公司目前已申请基因编辑、脱靶检测、新型CRISPR及药物递送等专利70+项，授权50+项。同时，公司具备先进的CGT原料规模化生产能力，可为科研机构及生物医药企业提供安全高效的一站式服务和原料供应。舒桐科技坚持以“创新、敬业、融合、开放”为核心价值观，致力于利用基因治疗技术造福人类健康，让生命更美好。

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