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【文献综述】RNA编辑系统的进化
人阅读 发布时间：2023-08-04 15:33
RNA编辑（RNA editing）技术能够对RNA转录本直接进行编辑，从能能够修正基因在转录和剪接层面上发生的错误。相较于DNA编辑技术，RNA编辑技术在由突变导致的人类疾病的治疗中，具有更实际的应用价值。随着基因编辑技术的不断发展，RNA编辑系统在原理和编辑效率上也得到了巨大的改进。今天，舒桐科技小编将就RNA编辑系统为大家进行介绍和总结。
现有的RNA编辑技术是基于RNA腺苷脱氨酶（Adenosine deaminase acting on RNA，ADAR）建立的碱基编辑技术。ADAR是一类在人体内各组织中广泛表达的腺苷脱氨酶，能够催化RNA分子中腺苷A到肌苷I（鸟苷G）的转换。相比DNA编辑，RNA编辑不需要对基因组序列进行长期改变，这种可逆的、易于调控的编辑方式在安全性上可能更具优势。小编将就这两种编辑作用分别进行介绍。
1. A-to-G 编辑系统
ADAR能够催化腺苷的脱氨作用，从而使腺苷（A）变为肌苷（I），即发生A-I的转换。在RNA转录和翻译的过程中，肌苷（I）会被识别为鸟苷（G），从而到达A-G的编辑效果。早在2017年，张锋实验室发明了REPAIR（RNA Editing for Programmable A to I Replacement）编辑技术（ref. 1），该技术将ADAR2的催化结构域与Cas13b进行融合，通过Cas13b-crRNA进行定位到靶向位点，并利用ADAR催化A-I的转化（图1）。
图1. REPAIR编辑系统原理示意图
通过进一步的研究，北京大学魏文胜教授发现， A-I的碱基编辑系统是可以脱离Cas13b，由ADAR2单独实现的（ref. 2），因此，REPAIR系统可以进一步简化。在此基础上，基于内源ADAR2和环状gRNA技术的LEAPER（Leveraging Endogenous ADAR for Programmable Editing on RNA）编辑系统诞生了。 相比于线性的gRNA，环状gRNA能够提高A-I的编辑效率（~3.1倍），并降低脱靶效率。环形RNA没有5’或3’末端，可以避免核酸外切酶的切割，在细胞内相比于线性RNA具有更好的稳定性和更长的半衰期。 LEAPER不影响内源ADAR蛋白的正常功能，也不会激活细胞中的天然免疫反应，是一类安全的基因编辑工具。
图2 LEAPER编辑系统原理示意图
2. C-to-U编辑系统
基于ADAR脱氨酶的RNA编辑技术只能能实现A-G的编辑，而现实中对RNA的单碱基编辑还有更广泛的需求。 因此，张锋实验室在2019年将ADAR2进行突变，得到了能够将C脱氨并转换为T的ADAR2突变体（CDAR），从而发明了RESCUE（RNA Editing for Specific C to U Exchange）编辑技术（ref. 4）。由于该技术使用的脱氨酶是ADAR2的突变体，因此RESCUE编辑系统中的会有一定比例的A-I编辑产物（图3）。
图3. RESCUE编辑系统原理示意图
同时，张峰实验室的RESCUE编辑技术对密码子碱基有一定的偏好性（ref. 4），德国图宾根大学Thorsten Stafforst团队用SNAP取代dCas13b负责靶向RNA，并将来源于RESCUE工具的脱氨酶（CDAR）结构域融合到SNAP蛋白上。创建了新的RNA编辑工具SNAP-CDAR-S（ref. 5）。该编辑系统利用SNAP蛋白的自标记特性，将经过苯甲基鸟嘌呤（benzylguanine, BG）修饰的gRNA引导到靶位点进行编辑（图4）。SNAP-CDAR-S编辑系统能够显著提高5’-CCN序列背景下的编辑产量，从而提高了该工具的底物范围（图5）。
图4. SNAP-CDAR-S编辑系统原理示意图
图5. SNAP-CDAR-S和RESCUE编辑系统对密码子碱基的偏好性
3. 不同编辑系统对比
RNA编辑是近年来兴起的基因编辑技术，随着技术的迭代，安全性更好，效率更高的编辑系统不断涌现。方便广大读者，小编归纳总结了本文介绍的几种RNA编辑系统的特点，如下表所示。
舒桐科技深耕基因编辑技术10余年，建立了一站式基因编辑平台，可用多种工具对sgRNA设计、在靶/脱靶评分。如有需求，欢迎咨询！
参考文献：
1. David B. T. Cox et al., RNA editing with CRISPR-Cas13. Science 358, 1019-1027 (2017).
2. Qu, L., Yi, Z., Zhu, S. et al. Programmable RNA editing by recruiting endogenous ADAR using engineered RNAs. Nat Biotechnol 37, 1059–1069 (2019).
3. Yi, Z. et al. Engineered circular ADAR-recruiting RNAs increase the efficiency and fidelity of RNA editing in vitro and in vivo. Nat Biotechnol 40, 946–955 (2022).
4. Omar O. Abudayyeh et al. A cytosine deaminase for programmable single-base RNA editing. Science 365,382-386 (2019).
5. Ngadhnjim Latifi et.al., Precise and efficient C-to-U RNA base editing with SNAP-CDAR-S, Nucleic Acids Research, 2023
现有的RNA编辑技术是基于RNA腺苷脱氨酶（Adenosine deaminase acting on RNA，ADAR）建立的碱基编辑技术。ADAR是一类在人体内各组织中广泛表达的腺苷脱氨酶，能够催化RNA分子中腺苷A到肌苷I（鸟苷G）的转换。相比DNA编辑，RNA编辑不需要对基因组序列进行长期改变，这种可逆的、易于调控的编辑方式在安全性上可能更具优势。小编将就这两种编辑作用分别进行介绍。
1. A-to-G 编辑系统
ADAR能够催化腺苷的脱氨作用，从而使腺苷（A）变为肌苷（I），即发生A-I的转换。在RNA转录和翻译的过程中，肌苷（I）会被识别为鸟苷（G），从而到达A-G的编辑效果。早在2017年，张锋实验室发明了REPAIR（RNA Editing for Programmable A to I Replacement）编辑技术（ref. 1），该技术将ADAR2的催化结构域与Cas13b进行融合，通过Cas13b-crRNA进行定位到靶向位点，并利用ADAR催化A-I的转化（图1）。
图1. REPAIR编辑系统原理示意图
通过进一步的研究，北京大学魏文胜教授发现， A-I的碱基编辑系统是可以脱离Cas13b，由ADAR2单独实现的（ref. 2），因此，REPAIR系统可以进一步简化。在此基础上，基于内源ADAR2和环状gRNA技术的LEAPER（Leveraging Endogenous ADAR for Programmable Editing on RNA）编辑系统诞生了。 相比于线性的gRNA，环状gRNA能够提高A-I的编辑效率（~3.1倍），并降低脱靶效率。环形RNA没有5’或3’末端，可以避免核酸外切酶的切割，在细胞内相比于线性RNA具有更好的稳定性和更长的半衰期。 LEAPER不影响内源ADAR蛋白的正常功能，也不会激活细胞中的天然免疫反应，是一类安全的基因编辑工具。
图2 LEAPER编辑系统原理示意图
2. C-to-U编辑系统
基于ADAR脱氨酶的RNA编辑技术只能能实现A-G的编辑，而现实中对RNA的单碱基编辑还有更广泛的需求。 因此，张锋实验室在2019年将ADAR2进行突变，得到了能够将C脱氨并转换为T的ADAR2突变体（CDAR），从而发明了RESCUE（RNA Editing for Specific C to U Exchange）编辑技术（ref. 4）。由于该技术使用的脱氨酶是ADAR2的突变体，因此RESCUE编辑系统中的会有一定比例的A-I编辑产物（图3）。
图3. RESCUE编辑系统原理示意图
同时，张峰实验室的RESCUE编辑技术对密码子碱基有一定的偏好性（ref. 4），德国图宾根大学Thorsten Stafforst团队用SNAP取代dCas13b负责靶向RNA，并将来源于RESCUE工具的脱氨酶（CDAR）结构域融合到SNAP蛋白上。创建了新的RNA编辑工具SNAP-CDAR-S（ref. 5）。该编辑系统利用SNAP蛋白的自标记特性，将经过苯甲基鸟嘌呤（benzylguanine, BG）修饰的gRNA引导到靶位点进行编辑（图4）。SNAP-CDAR-S编辑系统能够显著提高5’-CCN序列背景下的编辑产量，从而提高了该工具的底物范围（图5）。
图4. SNAP-CDAR-S编辑系统原理示意图
图5. SNAP-CDAR-S和RESCUE编辑系统对密码子碱基的偏好性
3. 不同编辑系统对比
RNA编辑是近年来兴起的基因编辑技术，随着技术的迭代，安全性更好，效率更高的编辑系统不断涌现。方便广大读者，小编归纳总结了本文介绍的几种RNA编辑系统的特点，如下表所示。
| A-to-G | C-to-U | |||
| 编辑系统 | REPAIR | LEAPER 2.0 | RESCUE | SNAP-CDAR-S |
| 定位系统 | Cas13b+gRNA | ADAR + circ-gRNA | Cas13b+gRNA | ADAR + gRNA |
| Cas13来源 | Prevotella sp. P5-125 | - | Riemerella anatipestifer | - |
| 脱氨酶 | ADAR2E488Q | ADAR2S375A | ADAR2S375A | |
| 脱氨酶来源 | 外源突变体 | 内源 | 外源突变体 | 外源突变体 |
| 特性 | A-I 编辑 | 环状gRNA；内源ADAR；稳定性好；脱把率低； | A-I和C-U编辑产物同时存在 | gRNA需经过苯甲基鸟嘌呤修饰；5‘-CN编辑效率高；A-I和C-U编辑产物同时存在 |
舒桐科技深耕基因编辑技术10余年，建立了一站式基因编辑平台，可用多种工具对sgRNA设计、在靶/脱靶评分。如有需求，欢迎咨询！
关于舒桐
珠海舒桐医疗科技有限公司深耕基因编辑技术10余年，是一家以基因编辑为核心技术的生物医药服务企业，可承接脱靶检测、细胞株定制、病毒包装等CRO及CDMO业务。目前，舒桐科技拥有3000㎡的GMP研发实验室及生产车间；拥有博士后科研工作站及澳门理工大学教学科研实习基地。研发团队熟练掌握各类基因编辑技术，包括基因编辑、碱基编辑及先导编辑等，成功完成如基因敲除、点突变、大片段插入、过表达等细胞系构建项目；开发了多种具有自主知识产权的脱靶检测技术，建立了高通量的sgRNA筛选平台；建立了工厂化新型CRISPR挖掘体系，已开发出多种切割效率高且低脱靶的新型CRISPR。公司目前已申请基因编辑、脱靶检测、新型CRISPR及药物递送等专利70+项，授权50+项。同时，公司具备先进的CGT原料规模化生产能力，可为科研机构及生物医药企业提供安全高效的一站式服务和原料供应。舒桐科技坚持以“创新、敬业、融合、开放”为核心价值观，致力于利用基因治疗技术造福人类健康，让生命更美好。如需获得更多信息，请咨询我们：
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参考文献：
1. David B. T. Cox et al., RNA editing with CRISPR-Cas13. Science 358, 1019-1027 (2017).
2. Qu, L., Yi, Z., Zhu, S. et al. Programmable RNA editing by recruiting endogenous ADAR using engineered RNAs. Nat Biotechnol 37, 1059–1069 (2019).
3. Yi, Z. et al. Engineered circular ADAR-recruiting RNAs increase the efficiency and fidelity of RNA editing in vitro and in vivo. Nat Biotechnol 40, 946–955 (2022).
4. Omar O. Abudayyeh et al. A cytosine deaminase for programmable single-base RNA editing. Science 365,382-386 (2019).
5. Ngadhnjim Latifi et.al., Precise and efficient C-to-U RNA base editing with SNAP-CDAR-S, Nucleic Acids Research, 2023
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